Что может являться материалом для паразитологического исследования

Лабораторная диагностика паразитарных болезней у людей

Возбудители паразитарных болезней могут быть обнаружены в окружающей среде при проведении санитарно-паразитологических исследований пищевых продуктов, воды, почвы, что необходимо при обеспечении профилактических мероприятий.

Для диагностики паразитозов человека исследуются биологические материалы, результаты анализов являются основанием для постановки диагноза.

За 9 месяцев 2020г. лабораториями ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Тульской области» выполнено около девяти тысяч исследований биоматериалов от людей, что составило 67% в структуре всех исследований.

За 9 месяцев 2020г. лабораториями ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Тульской области» при проведении исследований биоматериалов (кал, отпечатки с перианальных складок и др.) от людей паразитологическими методами выявлены 5 видов возбудителей кишечных гельминтозов и протозоозов: острицы; аскариды; описторхи; лямблии, бластоцисты; при исследовании препаратов крови, окрашенных по Романовскому –Гимза диагносцированы 2 случая тропической малярии.

Лабораторная диагностика прямыми паразитологическими методами в результате которой можно обнаружить возбудителей паразитарных инвазий (яйца гельминтов, цисты и трофозоиты простейших, членики, стробилы и др.) при тканевых паразитозах не используется. Инструментальными методами диагностики и серологическими исследованиями устанавливают диагнозы эхинококкоза, альвеококкоза, цистицеркоза, токсоплазмоза. Клинические проявления; качественные и количественные результаты лабораторного контроля специфических антител необходимо анализировать при наблюдении за пациентами с диагнозами трихинеллёз, токсокароз. За 9 мес. 2020г. паразитологическая лаборатория ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Тульской области» выполнила методом иммуноферментного анализа 760 исследований. За 9 мес. 2020г. доля серопозитивных среди всех пациентов, обследованных в паразитологической лаборатории, на эхинококкоз составила 11%; на трихинеллёз 3,3%.

С целью профилактики паразитарных болезней:

Соблюдайте меры личной гигиены!

Воспитывайте у детей гигиенические навыки!

Тщательно мойте плоды, овощи, зелень, ягоды!

Используйте в пищу продукты прошедшие ветеринарно-санитарный контроль! Не употребляйте пищевое сырьё и продукцию неизвестного происхождения!

Употребляйте чистую воду (бутилированную, кипячёную, обеззараженную УФ и специальным фильтрованием)!

Будьте аккуратны при контактах с животными!

Не используйте необработанные фекальные отходы в качестве удобрений на дачных участках!

Источник

Правила отбора проб биоматериалов человека для лабораторной диагностики кишечных гельминтозов и протозоозов.

Для лабораторных исследований на кишечные гельминтозы и протозоозы человека наиболее часто требуется отобрать кал и отпечаток (соскоб) с перианальных складок. В кале можно обнаружить яйца аскарид, широкого лентеца, описторха, кишечных простейших и других возбудителей паразитарных болезней. Отпечатки (соскобы) с перианальных складок более эффективны для лабораторной диагностики энтеробиоза и тениидозов (бычьего и свиного цепня).

Пробы биоматериала для проведения паразитологических исследований направляют в лабораторию в соответствии с МУ 4.2.2039-05 «Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории»: при наличии клинических показаний; при обследовании декретированных контингентов (работники общепита, детских образовательных учреждений, плавательных бассейнов и др); при плановом обследовании населения.

Согласно СП 3.2.3110-13 «Профилактика энтеробиоза» плановые профилактические обследования детей и обслуживающего персонала в детских дошкольных коллективах и коллективах младшего школьного возраста проводятся один раз в год (после летнего периода, при формировании коллектива) и (или) по эпидемическим показаниям.

Что нужно знать при отборе проб биоматериалов человека для проведения лабораторного исследования на кишечные паразитозы.

Как отобрать соскоб с перианальных складок? В соответствии с МУ 4.2.2039-05 «Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории»:

Посуду, предметное стекло получают в лаборатории накануне.

Пациенту не следует принимать душ и подмываться вечером накануне отбора пробы.

Пробу следует отобрать рано утром, когда пациент (обследуемый) только проснулся, до дефекации и душа.

Соскоб методом «отпечатка». Отклеить полоску липкой ленты от предметного стекла, держа полоску за концы, плотно прижать всей липкой поверхностью к анусу и перианальным складкам, не касаясь пальцами перианальной области. Отклеивают полоску от кожи перианальной области и переносят на предметное стекло липким слоем вниз, приклеивают к стеклу равномерно для избежания образования пузырьков воздуха.

Е сли в области перианальных складок есть язвы или воспаления, то пользуются ватным тампоном на шпателе, помещённом в пробирку. Тампон смачивают в глицерине.

С оскоб с применением стеклянных глазных палочек с клеевым слоем. Взять отпечаток путем плотного прижатия плоских частей глазной лопаточки к коже перианальных складок. Укрепить палочку в штативе или пенициллиновых пузырьках для доставки в лабораторию.

Как отобрать фекалии для паразитологического исследования? В соответствии с МУ 4.2.2039-05 «Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории»:

Перед сбором пробы не принимать антигельминтные, антидиарейные препараты, минеральное масло, висмут, барий, активированный уголь и др. Допустимы солевые и растительные слабительные, если они необходимы пациенту.

Посуда для сбора материала – это чистая (прокипячённая) сухая стеклянная банка или одноразовый контейнер с широким горлом и плотно закрывающимися крышками.

Фекалии (утреннюю порцию) после дефекации собирают в посуду из разных участков в объёме не менее 50г, не загрязняя внешние края контейнера.

Контейнер с пробой доставляют в лабораторию в полиэтиленовом мешке. При отсутствии возможности доставки пробы в лабораторию в течение 1-2 часов, материал рекомендуется хранить при температуре 4-8 град. С.

При подозрении на активное выделение члеников гельминтов (активное выделение члеников подобно актам непроизвольной дефекации):

Необходимо протереть область перианальных складок чистой ватой, вату поместить в чистую баночку, добавить небольшое количество воды (кипячёной, охлаждённой), доставить в лабораторию.

Если членики (лапшевидные молочно-белые образования) остались на белье, их тоже нужно собрать ватой и положить в ёмкость для лабораторного исследования.

П ри пассивном выделении члеников гельминтов в фекалиях можно увидеть лапшевидные молочно-белые образования размером 1см х 3см и более. Эти фрагменты нужно доставить в лабораторию вместе с фекалиями.

При подозрениях на паразитарные заболевания обращайтесь к врачу!

Источник

Что может являться материалом для паразитологического исследования

3.2. ПРОФИЛАКТИКА ПАРАЗИТАРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Паразитологические методы лабораторной диагностики
гельминтозов и протозоозов

Дата введения 1999-04-25

1. ПОДГОТОВЛЕНЫ сотрудниками Федерального центра государственного санитарно-эпидемиологического надзора Минздрава России: к.б.н. Т.Н.Цыбиной, Т.Г.Сысковой и сотрудниками Института медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И.Марциновского Минздрава России: к.м.н. Г.Л.Плющевой, к.б.н. Л.М.Гордеевой, к.м.н. А.И.Чернышенко, д.м.н. В.П.Сергиевым, д.м.н. Н.А.Романенко, к.м.н. Т.В.Продеус.

2. УТВЕРЖДЕНЫ И ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 25 февраля 1999 г.

1. Область применения и нормативные ссылки

Лабораторные исследования на гельминтозы и протозоозы проводятся клинико-диагностическими лабораториями лечебно-профилактических учреждений, ведомственными лабораториями (НИИ, вузов, военных госпиталей, частных клиник и т.п.), а также другими лабораториями, имеющими лицензии или аккредитованными в системе Госстандарта и госсанэпиднадзора для проведения данных исследований в независимости от формы собственности.

На центры госсанэпиднадзора возлагается организация работы по обследованию населения на гельминтозы и протозоозы, методическое руководство, контроль за качеством работы, проводимой клинико-диагностическими лабораториями лечебно-профилактических учреждений и ведомственных лабораторий, обследование населения по эпидемиологическим показаниям и с консультативной целью.

В настоящих методических указаниях использованы ссылки на:

Настоящие методические указания являются обязательными при выполнении лабораторных исследований биологического материала от людей с целью обнаружения паразитирующих в организме гельминтов и простейших.

Важность качественной лабораторной диагностики паразитарных заболеваний определяется во многих случаях трудностью их клинической и эпидемиологической диагностики. Многие инвазии у людей, в т.ч. у детей, нередко протекают субклинически, латентно.

В связи с этим грамотная лабораторная диагностика инвазий приобретает неоценимое значение. Качество лабораторной диагностики и уровень выявляемости зависят от тщательного выполнения всех требований любой методики, правильного выбора материала для исследования, знания циклов развития гельминтов, простейших, а также путей выделения из организма человека, морфологического строения яиц гельминтов и различных форм простейших. На результат анализа также влияет: неправильный забор материала или длительное его хранение, а также отсутствие подготовки больного лечащим врачом перед лабораторным обследованием.

Разнообразие возбудителей, форм паразитирования, и способов выделения диагностических стадий определяет достаточно широкий спектр методов диагностики.

Методы лабораторной диагностики паразитарных заболеваний применяются:

— с диагностической целью;

— для контроля эффективности лечения паразитарных заболеваний;

— для оценки качества проведения комплекса противопаразитарных мероприятий;

— с целью выявления источников заражения;

— для установления уровня пораженности населения.

Данный документ включает паразитологические методы лабораторной диагностики наиболее распространенных паразитарных заболеваний.

2. Отбор проб и условия доставки материала в лабораторию
для паразитологического исследования

Материалом для лабораторных паразитологических исследований на гельминтозы и протозоозы служит различный биологический материал от человека: дуоденальное содержимое, кал, ректальная слизь, моча, мокрота, отделяемое бронхов, кровь, биопсийные ткани и др.

2.1. Отбор проб и доставка фекалий (кала)

— Фекалии после дефекации отбирают из разных участков в количестве не менее 50 г (объем примерно от чайной до столовой ложки).

— Помещают в чистую (прокипяченную), сухую, стеклянную или пластмассовую посуду с крышками.

— Стерильная стеклянная (пластиковая) посуда требуется при заборе кала для исследования на амебиаз.

— Кал должен быть доставлен в лабораторию и исследован в день дефекации, поэтому, как правило, доставляется утренний кал.

— Для обнаружения яиц стронгилоидеса кал доставляется и исследуется не позднее 1 ч после дефекации.

— Для обнаружения личинок стронгилоидеса, яиц анкилостомид и трихостронгилоид исследуется кал не позднее 4 ч после дефекации.

— Для обнаружения вегетативных (подвижных) форм дизентерийной амебы необходимо кал доставить и провести исследование не позднее 20 мин после дефекации или 40 мин, если это время кал сохранялся при температуре 4 °С.

— Для обнаружения вегетативных форм кишечных простейших (лямблий, диэнтамебы и др.) в жидком и полуоформленном «стуле» время от дефекации до исследования должно быть по возможности сокращено до минимума (не более 1-1,5 ч).

2.1.1. Отбор проб фекалий в консерванты

— при невозможности исследования кала сразу же после дефекации или в день поступления материала в лабораторию.

Физический способ хранения фекалий:

— при низкой температуре от 0 до 4 °С не более суток.

1. Жидкость Барбагалло: раствор формалина на физиологическом растворе (3 мл формалина 40% + 97 мл физраствора или 1 л дистиллированной воды + 30 мл формалина 40% + 8,5 г хлорида натрия).

2. Раствор формалина 4%-ный.

3. Смесь 4%-ного раствора формалина с равным количеством глицерина.

4. Раствор уксусной кислоты от 3 до 10%.

Заливается кал одним из приготовленных консервантов в объеме 1:1 или 1 часть фекалий и 2 части раствора консерванта, при этом тщательно перемешивается индивидуальной палочкой.

Хранить фекалии в растворах консервантов можно от нескольких месяцев до года, при более длительном хранении возможно разрушение яиц гельминтов.

6. Для консервации простейших кишечника фекалии можно поместить в консервант Турдыева: 80,0 мл 0,2%-ного раствора азотистокислого натрия (0,16 г NaNO + 80,0 мл воды дистиллированной) + 2,0 мл глицерина + 10 мл концентрированного формалина (аптечного) + 8,0 мл концентрированного раствора Люголя (см. п.4.2.4.1).

Смешивать в соотношении: 1 часть кала и 3 части консерванта.

7. Химические консерванты для консервации и хранения взрослых гельминтов или их фрагментов:

8. Для консервации мышц с личинками трихинелл используется концентрированный раствор хлористого натрия (на 100 мл воды 40-50 г NaCI).

2.1.2. Отбор соскобов с перианальных складок

— Соскоб с перианальных складок можно забирать у обследуемого в лаборатории, или заранее выдавать пробирки с ватными тампонами, смоченными в глицерине, на шпателях или флаконы с глазными палочками, покрытыми специальным клеевым слоем (п.4.2.3), предварительно проинструктировав обследуемого (если обследуется ребенок, то родителей ребенка) о способе забора материала и доставке его в лабораторию.

— Утром (вечером и утром обследуемому не подмываться) собрать соскоб с перианальных складок вокруг ануса методом «смыва» или «отпечатка» приготовленным ватным тампоном, смоченным в глицерине, или липкой лентой, или глазными стеклянными палочками со специальным клеевым слоем, как описано в п.4.2.3.

— После забора соскоба шпатели вкладываются обратно в пробирку, липкая лента наклеивается на предметное стекло, а глазные палочки вкладываются в соответствующий флакон или специальный контейнер с штативами. Пробирки, флаконы, предметные стекла предварительно маркируются (при массовых обследованиях маркируются цифрами согласно списку обследуемых).

2.2. Отбор дуоденального содержимого (желчь)

— Материал доставляется в лабораторию в чистых химических или центрифужных пробирках сразу после зондирования пациента натощак.

— Доставляют все три фракции (порции «А», «В», «С») и исследуют сразу после поступления в лабораторию.

— Порцию «А» доставляют для исследования на патогенные простейшие двенадцатиперстной кишки (лямблии), личинки стронгилоидеса, трихостронгилид, анкилостомид.

— Порции «В» и «С» доставляют для исследования на яйца гельминтов, паразитирующих в протоках печени и поджелудочной железы.

2.3. Отбор проб мокроты

— Доставляется в лабораторию мокрота, выделенная при откашливании (не слюна и не слизь с носоглотки), в стерильной посуде с крышками (можно в чашках Петри).

— Исследуется сразу после поступления.

2.4. Отбор проб мочи

— Доставляется в лабораторию моча утреннего сбора в чистых стеклянных банках с крышками.

— Исследуется сразу после поступления в лабораторию.

2.5. Отбор проб эпидермиса кожи

— С участков кожи (где изменения кожи или зуд) делают несколько срезов.

— Поверхностные срезы кожи диаметром 2-3 мм делают бескровно, с соблюдением асептики, стерильным лезвием бритвы или глазным скальпелем, предварительно приподняв кожу кончиком стерильной иглы.

— Помещают кусочки кожи в стерильную стеклянную посуду (можно чашки Петри) с физраствором.

— Исследуют сразу после забора материала.

2.6. Биопсия мышечной ткани (поперечно полосатой мускулатуры)

— Хирургическим путем получают биопсированные кусочки двуглавой или икроножной мышц (ближе к сухожилию).

Источник

1. Область применения и нормативные ссылки

Лабораторные исследования на гельминтозы и протозоозы проводятся клинико-диагностическими лабораториями лечебно-профилактических учреждений, ведомственными лабораториями (НИИ, вузов, военных госпиталей, частных клиник и т.п.), а также другими лабораториями, имеющими лицензии или аккредитованными в системе Госстандарта и Госсанэпиднадзора для проведения данных исследований в независимости от формы собственности.

На центры Госсанэпиднадзора возлагается организация работы по обследованию населения на гельминтозы и протозоозы, методическое руководство, контроль за качеством работы, проводимой клинико-диагностическими лабораториями лечебно-профилактических учреждений и ведомственных лабораторий, обследование населения по эпидемиологическим показаниям и с консультативной целью.

В настоящих методических указаниях использованы ссылки на:

Методы лабораторной диагностики паразитарных заболеваний применяются:

— с диагностической целью;

— для контроля эффективности лечения паразитарных заболеваний;

— для оценки качества проведения комплекса противопаразитарных мероприятий;

— с целью выявления источников заражения;

— для установления уровня пораженности населения.

2. Отбор проб и условия доставки материала в лабораторию для паразитологического исследования

2.1. Отбор проб и доставка фекалий (кала)

— Помещают в чистую (прокипяченную), сухую, стеклянную или пластмассовую посуду с крышками.

— Стерильная стеклянная (пластиковая) посуда требуется при заборе кала, для исследования на амебиаз.

— Для обнаружения яиц стронгилоидеса кал доставляется и исследуется не позднее 1 ч после дефекации.

Физический способ хранения фекалий:

— при низкой температуре от 0 до 4 °С не более суток.

1. Жидкость Барбагалло: раствор формалина на физиологическом растворе (3 мл формалина 40 % + 97 мл физраствора или 1 л дистиллированной воды + 30 мл формалина 40 % + 8,5 г хлорида натрия).

2. Раствор формалина 4 %-ный.

3. Смесь 4 %-ного раствора формалина с равным количеством глицерина.

4. Раствор уксусной кислоты от 3 до 10 %.

6. Для консервации простейших кишечника фекалии можно поместить в консервант Турдыева: 80,0 мл 0,2 %-ного раствора азотистокислого натрия (0,16 г NaNO₂ + 80,0 мл воды дистиллированной) + 2,0 мл глицерина + 10 мл концентрированного формалина (аптечного) + 8,0 мл концентрированного раствора Люголя (см. п. 4.2.4.1).

Смешивать в соотношении: 1 часть кала и 3 части консерванта.

7. Химические консерванты для консервации и хранения взрослых гельминтов или их фрагментов:

— Соскоб с перианальных складок можно забирать у обследуемого в лаборатории, или заранее выдавать пробирки с ватными тампонами, смоченными в глицерине, на шпателях или флаконы с глазными палочками, покрытыми специальным клеевым слоем (п. 4.2.3), предварительно проинструктировав обследуемого (если обследуется ребенок, то родителей ребенка) о способе забора материала и доставке его в лабораторию.

2.2. Отбор дуоденального содержимого (желчь)

— Доставляют все три фракции (порции «А», «В», «С») и исследуют сразу после поступления в лабораторию.

2.3. Отбор проб мокроты

— Исследуется сразу после поступления.

2.4. Отбор проб мочи

— Доставляется в лабораторию моча утреннего сбора в чистых стеклянных банках с крышками.

— Исследуется сразу после поступления в лабораторию.

2.5. Отбор проб эпидермиса кожи

— С участков кожи (где изменения кожи или зуд) делают несколько срезов.

— Помещают кусочки кожи в стерильную стеклянную посуду (можно чашки Петри) с физраствором.

— Исследуют сразу после забора материала.

2.6. Биопсия мышечной ткани (поперечно полосатой мускулатуры)

— Хирургическим путем получают биопсированные кусочки двуглавой или икроножной мышц (ближе к сухожилию).

— Помещают в стерильную стеклянную посуду с физраствором.

— Исследуют сразу после биопсии.

2.7. Отбор проб для контроля эффективности лечения кишечных, печеночных гельминтозов и протозоозов

— После лечения инвазий желчевыводящих путей контроль эффективности можно проводить как при исследовании кала, так и желчи, применяя соответствующие методы лабораторного исследования.

— При стронгилоидозе контроль эффективности проводится только при исследовании желчи (даже, если паразит был обнаружен копроскопическими методами) через месяц после лечения.

3. Паразитологические методы лабораторной диагностики

Макро- и микроскопические паразитологические методы лабораторной диагностики являются прямыми методами обнаружения гельминтов, их фрагментов, яиц и личинок гельминтов; вегетативных и цистных форм патогенных простейших, при обнаружении и идентификации которых не требуются косвенные методы исследования.

Все микроскопические методы применяются по показаниям (см. описание в конце каждого метода).

При плановых и профилактических осмотрах детского контингента, а также при обследовании декретированных групп населения необходимо обследовать пациента одновременно методом перианального соскоба в сочетании с одним из копроовоскопических методов и методом нативного мазка с раствором Люголя.

При обследовании больного в направлении для лаборатории необходимо указать предварительный диагноз, что позволит лаборанту выбрать соответствующую методику для выявления или исключения данного вида возбудителя. При отсутствии в направлениях врачей четкого диагноза и затруднении в выборе эффективного метода лабораторного исследования на кишечные простейшие и гельминты больного лучше обследовать с применением «комплексного» метода исследования фекалий из консерванта или универсального метода формалин-эфирного (уксусно-эфирного) осаждения.

При применении большинства паразитологических методов лабораторной диагностики учитывается эпидемиологический анамнез пребывания обследуемого на эндемичной по тем или иным паразитарным заболеваниям территории, контакт с домашними животными, геофагия или употребление в пищу продуктов питания, которые могут явиться источником заражения, и т.д., а также результаты косвенных и клинических методов обследования больного (серологические исследования, результаты рентгеноскопии, УЗИ, результаты общего анализа крови и т.д.)

4. Исследование фекалий

4.1. Макроскопические методы

Макроскопические методы служат для обнаружения в кале целых половозрелых гельминтов или их фрагментов невооруженным глазом или с помощью ручной лупы.

4.1.1. Метод визуального осмотра фекалий с последующим последовательным промыванием фекалий

На поверхности кала после дефекации можно видеть активно ползающих остриц; иногда выделяются с калом аскариды; у больных дифиллоботриозом могут выделяться обрывки стробилы лентеца (в виде «лапши»), а у инвазированных тениидами (свиной или бычий цепень) с калом часто отходят членики гельминтов (в виде «белых обсечек»), членики бычьего цепня могут активно выползать из анального отверстия.

Фекалии сначала осматривают целиком, затем разводят дистиллированной водой до жидкой консистенции и небольшими порциями исследуют при хорошем освещении.

Для лучшего просмотра фекалий применяют способ отстаивания.

Необходимые реактивы и оборудование

2. Физиологический раствор

3. Дистиллированная вода

4. Химические стаканы

8. Препаровальные иглы

9. Предметные стекла большие (6×10; 8×12 см)

10. Лотки эмалированные

11. Лупа, микроскоп и стереоскопический микроскоп типа МБС

— Размешать фекалии в большом количестве воды, в высоких стеклянных стаканах, банках и поставить отстаивать.

— Надосадочную жидкость слить, а осадок снова смешать с водой (таким образом проделывают несколько раз, пока надосадочный слой не станет прозрачным).

— Отливать отдельные небольшие порции в чашки Петри и тщательно просматривать под лупой, а лучше под стереоскопическим микроскопом МБС.

— Извлекать пинцетом или препаровальной иглой все подозрительные частицы и крупные образования на отдельное предметное стекло или чашку Петри.

— Образования, подозрительные на фрагменты гельминтов, рассматривать под лупой между двумя предметными стеклами или лучше под микроскопом МБС.

— Мелких гельминтов или сколексы цестод рассматривать в капле глицерина или физраствора под микроскопом при увеличении: окуляр ×7 или ×10, объектив ×8 или ×10.

— Микроскопия всех визуально обнаруженных в кале паразитов или фрагментов обязательна для уточнения морфологических особенностей и идентификации паразита.

— Эффективен для дифференциальной диагностики половозрелых гельминтов кишечника от непереваренных частиц и других включений кала и идентификации найденных паразитов.

— Достоверный метод при идентификации члеников бычьего и свиного цепня (т.к. обнаруживаемые при микроскопическом исследовании онкосферы у них идентичны, что не дает возможности дифференциальной диагностики), и наиболее эффективен в сочетании с методом опроса на отхождение у больного в момент дефекации «инородных» частиц.

— Перед методами микроскопии фекалий.

— При контроле эффективности лечения после применения лекарственных препаратов, не вызывающих деструкцию паразита.

— При идентификации зрелых паразитов или их фрагментов, например: для дифференциальной диагностики члеников цестод (бычьего, свиного цепня и широкого, чаечного лентеца).

4.2. Микроскопические методы

4.2.1. Копроовоскопия (исследование фекалий на яйца гельминтов)

4.2.1.1. Метод толстого мазка под целлофаном по Като и Миура

Толстый мазок представляет собой тонкий слой фекалий на предметном стекле под гигроскопическим целлофаном, пропитанным смесью глицерина и фенола.

Необходимые реактивы и оборудование

4. Целлофан (гигроскопический)

5. Предметные стекла

6. Палочки стеклянные или деревянные

7. Валик или резиновая пробка

Подготовка к работе

Приготовление рабочего раствора Като

100 мл 6 %-ного р-ра фенола + 100 мл глицерина + 1,2 мл 3 %-ного р-ра малахитового зеленого (раствор можно хранить длительное время в склянке из темного стекла с притертой крышкой).

Фенол дезинфицирует препарат; глицерин просветляет мазок; малахитовая зелень снимает напряжение глаз микроскописта.

При отсутствии фенола и малахитовой зелени можно использовать раствор глицерина (50 мл глицерина + 50 мл дистиллированной воды).

Подготовка целлофановых полосок

Нарезать полоски из гидрофильного целлофана (гидрофильный целлофан горит, в отличие от полиэтиленовой пленки, которая плавится и непригодна для исследования), чтобы их размер соответствовал размеру предметного стекла.

Полоски поместить в рабочий раствор Като не менее чем на 24 ч до проведения анализа. В 200 мл рабочего раствора можно обрабатывать до 5 тыс. новых целлофановых полосок.

— Фекалии накрыть целлофановой полоской, обработанной в растворе Като.

— Целлофан сверху притереть резиновой пробкой или специальным валиком, ширина которого соответствует или немного больше ширины предметного стекла, до получения тонкого, равномерного, прозрачного слоя.

— Микроскопировать при увеличении: объектив ×8 или ×10, окуляр ×7 или ×10 (для уточнения морфологического строения яиц гельминтов объектив ×40).

— Выявляет яйца кишечных и печеночных гельминтов при высокой и средней интенсивности инвазии.

— Менее эффективен для выявления инвазий низкой интенсивности.

— Рекомендуется при массовых обследованиях населения на кишечные гельминтозы, например: при обследовании декретированных контингентов взрослого населения и детей организованных коллективов.

— В клинико-диагностических лабораториях, когда в направлениях врачей отсутствуют конкретные диагнозы или указания, на какие инвазии необходимо обследовать больного, что не позволяет лаборанту выбрать специальные методы лабораторной диагностики.

— Препараты, приготовленные методом Като, можно сохранять при комнатной температуре в течение длительного времени (за исключением яиц анкилостомид и карликового цепня) в качестве музейных препаратов.

4.2.1.2. Формалин-эфирный метод (седиментация)

Необходимые реактивы и оборудование

1. Раствор формалина 10 %-ный (10 мл формалина аптечного + 90 мл дистиллированной воды)

2. Этиловый эфир медицинский

3. Раствор Люголя 1 %-ный

4. Центрифужные градуированные пробирки

5. Воронки стеклянные

6. Металлическое ситечко чайное или бинт (марля)

7. Предметные и покровные стекла

8. Деревянные и стеклянные палочки

10. Резиновые пробки

12. Центрифуга на 3000 об/мин.

— В центрифужные градуированные пробирки налить 7 мл 10 %-ного раствора формалина.

— Добавить 1 г фекалий (такое количество фекалий, чтобы раствор в пробирке поднялся до 8 мл).

— Фекалии тщательно смешать при помощи палочки (индивидуальной для каждого обследуемого) с формалином до образования однородной смеси.

— Процедить через воронку с металлическим ситечком или двухслойным бинтом в другую центрифужную пробирку (чтобы в новой пробирке процеженного раствора снова было 8 мл, если меньше, то дополнительно можно сполоснуть 10 %-ным раствором формалина воронку с бинтом, через который процеживали раствор фекалий).

— Добавить в эту пробирку 2 мл эфира, т.е. до метки 10 мл, закрыть пробкой и энергично встряхивать в течение 30 с (встряхивать желательно в вытяжном шкафу, в горизонтальном положении, придерживая при этом пробку).

— Смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 1 мин (или в течение 2 мин при 1500 об/мин).

— После центрифугирования в пробирке образуется 4 слоя: эфир, «каловая пробка», раствор формалина и на дне осадок, в котором будут содержаться яйца гельминтов и цисты простейших.

— «Каловую пробку» палочкой отделить от стенок пробирки и вместе с надосадочной жидкостью вылить, перевернув пробирку вверх дном, с краев пробирки убрать ватным тампоном лишнюю влагу, чтобы она не стекала на дно пробирки, перевернуть пробирку опять дном вниз.

— Осадок, оставшийся на дне пробирки, (весь) нанести на предметное стекло пипеткой или непосредственно из пробирки; капли должны быть небольшими, по 2 капли на одном предметном стекле.

— При исследовании на цисты простейших в одну из капель осадка внести каплю 1 %-ного раствора Люголя (приготовление в п. 4.2.4.1).

— Капли накрыть покровным стеклом (жидкость не должна выступать за края стекла или затекать на покровное стекло).

— Каплю с раствором Люголя исследуют на цисты и ооцисты простейших, а каплю без Люголя исследуют на яйца и личинки гельминтов.

— Эффективно выявляет инвазии с высокой, средней и низкой интенсивностью.

— Применяется для выявления яиц, личинок гельминтов кишечника и печени, цист и ооцист простейших кишечника, но практически не выявляет стадии трофозоитов.

— Не снижает эффективности при исследовании фекалий из консервантов.

— Применяется как универсальный метод диагностики кишечных и печеночных гельминтозов и протозоозов при диагностических и эпидемиологических обследованиях населения.

— Используется как специальный метод для диагностики трематодозов, включая описторхоз.

— Используется как количественный метод диагностики.

4.2.1.3. Уксусно-эфирный метод (седиментация)

Необходимые реактивы и оборудование

1. Водный раствор уксусной кислоты 5 %-ный (5 мл ледяной уксусной кислоты + 95 мл дистиллированной воды)

2. Раствор Люголя 1 %-ный

3. Этиловый эфир медицинский

4. Центрифужные градуированные пробирки

5. Воронки стеклянные

6. Металлическое ситечко чайное или двухслойный бинт

7. Предметные и покровные стекла

8. Палочки деревянные и стеклянные

11. Резиновые пробки

13. Центрифуга на 3000 об/мин

— В центрифужные градуированные пробирки налить 5 мл 5 %-ного раствора уксусной кислоты.

— Добавить 1 г фекалий (количество фекалий, чтобы раствор в пробирке поднялся до 6 мл).

— Фекалии тщательно смешать с уксусной кислотой при помощи палочки (индивидуальной для каждого обследуемого), закрыть пробирку резиновой пробкой и интенсивно встряхнуть до образования однородной смеси и дать постоять 1 мин.

— Процедить через воронку с металлическим ситечком или двухслойным бинтом в другую центрифужную пробирку (чтобы в новой пробирке процеженного раствора снова было 6 мл, если меньше, то дополнительно можно сполоснуть 5 %-ным раствором уксусной кислоты воронку с бинтом, через который процеживали суспензию фекалий).

— Добавить в эту пробирку 4 мл эфира, т.е. до метки 10 мл, закрыть пробкой и энергично встряхивать в течение 30 с, держа при этом пробирку в горизонтальном положении (встряхивать в вытяжном шкафу, придерживая пробку), до получения эмульгированной смеси.

— Смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 1 мин или в течение 2 мин при 1500 об/мин.

— После центрифугирования в пробирке различают 4 слоя: в верхней части пробирки эфирный экстракт, образовавшаяся «каловая пробка», раствор уксусной кислоты и на дне небольшой осадок.

Уксусная кислота эмульгирует фекалии, проникает в непереваренные частицы, состоящие преимущественно из клетчатки; удельный вес смеси эфира с уксусной кислотой меньше удельного веса воды, поэтому фекалии вместе с непереваренными крупными частицами клетчатки поднимаются в виде пробки в верхнюю часть пробирки, а яйца гельминтов и цисты простейших, обладающие большим удельным весом, выпадают в осадок.

— «Каловую пробку» круговым движением палочки отделить от стенок пробирки и вместе с надосадочной жидкостью вылить, при этом излишки влаги удалить ватным тампоном с края пробирки, оставив на дне осадок.

— Осадок (как правило, небольшой, бесцветный) нанести на предметные стекла пипеткой или непосредственно из пробирки, капли должны быть небольшими, по 2 капли на одном предметном стекле.

— Перед исследованием на цисты простейших в одну из капель осадка внести каплю 1 %-ного раствора Люголя.

— Обе капли накрыть покровным стеклом (осадок не должен выступать за края стекла или затекать на покровное стекло).

— Эффективно выявляет инвазии с высокой, средней и низкой интенсивностью.

— Применяется для выявления яиц, личинок гельминтов кишечника и печени, цист и ооцист простейших кишечника, т.к. 5 %-ный раствор уксусной кислоты не оказывает деформирующего воздействия на цисты и ооцисты простейших (при исследовании оформленных и неоформленных фекалий), но не сохраняет стадии трофозоитов.

— Не снижает эффективности при использовании фекалий из консервантов.

— Используется как специальный метод для диагностики трематодозов, включая описторхоз.

— Используется как количественный метод диагностики.

Необходимые реактивы и оборудование

1. Азотнокислый натрий

2. Раствор уксусной кислоты 1 %-ный

3. Раствор уксусной кислоты 10 %-ный

4. Эфир этиловый медицинский

6. Воронки стеклянные

8. Центрифужные пробирки

9. Предметные и покровные стекла

10. Пипетки стеклянные

11. Стеклянные или деревянные палочки

Подготовка к работе

Приготовить рабочие растворы:

1) азотно-кислого натрия с удельным весом 1,15

— после остывания приготовленного раствора проводят измерение удельного веса ареометром при комнатной температуре.

Если раствор готовится заранее, необходимо приготовить с более высоким удельным весом, т.к. уже через 24 ч удельный вес начинает падать;

2) растворы уксусной кислоты 1 %-ный и 10 %-ный.

— В градуированную центрифужную пробирку налить 6 мл рабочего раствора азотнокислого натрия.

— В другую пробирку налить 7 мл 1 %-ного раствора уксусной кислоты.

— Тщательно перемешать фекалии стеклянной палочкой.

— Процедить через воронку с одним слоем марли (бинта) в пробирку с азотно-кислым натрием.

— Слить надосадочную жидкость из пробирки.

— Закрыть резиновой пробкой и, придерживая пробку, энергично встряхнуть (в вытяжном шкафу).

— Провести повторное центрифугирование в течение 1 мин.

— Слить надосадочную жидкость.

— Осадок перенести на предметное стекло пипеткой.

— Каплю (или несколько капель) осадка накрыть предметным стеклом.

— После дополнительной обработки осадка химреактивами в нем остаются только яйца гельминтов, что облегчает их выявление.

— По эффективности выявления примерно одинаков с уксусно-эфирным осаждением, но более трудоемок.

Применяется для выявления яиц гельминтов кишечника, печени.

В основе методов флотации (всплывания) лежит разность удельного веса флотационного раствора и яиц гельминтов, удельный вес флотационного раствора выше, в результате яйца гельминтов всплывают на поверхность жидкости и обнаруживаются в поверхностной пленке.

Необходимые реактивы и оборудование

1. Один из флотационных растворов

3. Проволочная петля (из нескольких круглых петель диаметром от 0,5 до 1 см)

4. Предметные стекла (обезжиренные)

5. Пипетки стеклянные

7. Кюветы эмалированные

9. Стеклянные или деревянные палочки

Подготовка к работе

Приготовление флотационного раствора (по одной из нижеописанных прописей).

1. Раствор нитрата аммония NH₄NO₃ (гранулированной или обычной селитры) плотностью 1,3 готовят из расчета 1500 г вещества на 1 л горячей воды.

3. Раствор тиосульфата натрия Na₂S₂O₃ × 5H₂O (гипосульфита натрия) с плотностью 1,4 готовят из расчета 1750 г вещества на 1 л горячей воды.

Любую из выше предложенных солей растворяют в горячей воде в эмалированной посуде, причем кладут соль в емкость с горячей водой порциями при подогревании на плите и постоянном перемешивании до полного растворения.

Удельный вес флотационных растворов измеряется ареометром только после остывания раствора при комнатной температуре.

Измерение удельного веса флотационного раствора ареометром строго обязательно, т.к. приготовление раствора по прописи не гарантирует получение нужного удельного веса (например, когда используемая соль недостаточно химически чистая).

Фильтровать приготовленные растворы не обязательно. Если раствор приготовлен в большом количестве, то в последующие дни перед исследованием его подогревают с размешиванием осадка и после остывания раствора снова измеряют ареометром удельный вес.

Подготовка предметных стекол: предметные стекла обязательно обезжирить, например в смеси Никифорова (равные части этилового спирта и эфира).

— Поместить в стаканчик 2,5 г фекалий (объем с большой «боб»).

— Тщательно размешать палочкой (индивидуальной для каждого обследуемого).

— Удалить сразу же после размешивания всплывшие крупные частицы палочкой (или ложечкой с дырочками).

— Одновременно добавлять постепенно солевой раствор до 50 мл.

— При снятии поверхностной пленки предметным стеклом, стекло должно соприкасаться с жидкостью, поэтому стаканчик накрывается предметным стеклом, а флотационный раствор добавляется пипеткой до полного соприкосновения с предметным стеклом.

— После вышеуказанной экспозиции снять предметное стекло с химического стаканчика, перевернув кверху ту его поверхность, которой оно соприкасалось с жидкостью, и положить сухой поверхностью на стекло большего размера.

— При снятии поверхностной пленки проволочной петлей (лучше использовать петли с несколькими ячейками) целесообразно исследовать не менее 8 капель. Микроскопировать под покровным стеклом (можно и без покровного стекла, предварительно на предметное стекло нанеся каплю глицерина, в которой размазывают каплю с петли).

— Петли перед и после исследования обжигать на пламени спиртовой горелки.

— Наиболее эффективны методы флотации для обнаружения яиц нематод и цестод.

— Неэффективен для выявления яиц трематод.

— Для обнаружения яиц гельминтов кишечника.

2. Стеклянная воронка (диаметром 10 см)

3. Металлическое сито или сетка «мельничный газ»

4. Резиновая трубка с зажимом

5. Предметные стекла

6. Стеклянные или деревянные палочки

Подготовка к работе

Собрать аппарат Бермана, для чего закрепить в штативе стеклянную воронку с металлическим ситом. На нижний конец воронки надеть резиновую трубку с зажимом.

— Надосадочную жидкость быстро слить.

Осадок нанести на предметное стекло или в чашку Петри.

Микроскопировать при увеличении: объектив ×8 или ×10, окуляр ×7 или ×10 (можно использовать стереоскопический микроскоп МБС), уточнение морфологического строения при увеличении: объектив ×40, окуляр ×10.

— Является эффективным методом выявления рабдитовидных личинок стронгилоидес.

— Эффективность методики возрастает при увеличении экспозиции фекалий в воде.

— Применяется как специальный метод для диагностики стронгилоидоза.

Необходимые реактивы и оборудование

1. Дистиллированная вода

2. Химические стаканчики

3. Стеклянные палочки

5. Пробирки центрифужные

6. Стереоскопический микроскоп МБС

— Залить теплой (40 °С) дистиллированной водой, чтобы фекалии были полностью покрыты.

— Слить осторожно надосадочную жидкость, осадок поместить в чашку Петри.

— Исследовать осадок в чашке Петри под бинокулярным стереоскопическим микроскопом МБС (с нижней подсветкой) объектив ×2, окуляр ×12, ×14; обращая внимание на подвижных, слабоподвижных и неподвижных личинок.

— Неподвижные личинки микроскопируют с увеличением: объектив ×8, ×10 и ×40; окуляр ×10.

— Эффективен при высокой и средней интенсивности инвазии и менее эффективен при низкой интенсивности инвазии.

— Рекомендуется сочетать с исследованием дуоденального содержимого.

— Чаще используется для диагностики стронгилоидоза при массовых обследованиях.

4.2.2.3. Метод культивирования личинок на фильтровальной бумаге (метод Харада-Мори в модификации Маруашвили)

1. Фильтровальная бумага (размером 16×3,5 см)

3. Полиэтиленовая пленка

— На фильтровальную бумагу нанести свежевыделенные фекалии в виде мазка, оставляя края фильтровальной бумаги свободными.

— Смочить стенки банки водой, опустить в банку фильтровальную бумагу и поверхностью без фекалий зафиксировать ее на стенках банки.

— Налить в банку воды так, чтобы в нее был погружен нижний конец бумаги без фекалий.

— Верх банки закрыть полиэтиленовой пленкой или чашкой Петри.

— Часть личинок может подняться вверх по фильтровальной бумаге, поэтому работа должна проводиться с соблюдением техники безопасности.

— Эффективен для обнаружения и идентификации личинок анкилостомид.

— Для диагностики анкилостомидозов.

Необходимые реактивы и оборудование

Кроме микроскопа, необходимое оборудование зависит от способа получения соскоба: деревянный шпатель, шпатель с ватным тампоном, предметные и покровные стекла, полоски прозрачной липкой ленты, глазные палочки со специальным клеевым слоем и др.

Подготовка к работе

При массовых обследованиях населения (в основном детского) заранее подготовить шпатели с тампонами и пробирки, или предметные стекла с липкой лентой, флаконы, или специальные штативы с глазными палочками, покрытыми клеевым слоем. Промаркировать предметные стекла, пробирки или флаконы, либо маркировать во время забора материала у обследуемых, согласно номеру по списку. Методы отбора соскобов с перианальных складок см. п. 2.1.2.

Ход исследования: зависит от способа отбора материала.

4.2.3.1. Метод перианального соскоба липкой лентой по Грэхем

— Перед взятием соскоба отклеить полоску липкой ленты от предметного стекла, держа полоску за концы, плотно прижать всей липкой поверхностью к анусу и перианальным складкам, стараясь пальцами рук не касаться перианальной области.

— Отклеить полоску от кожи перианальной области и перенести на предметное стекло липким слоем вниз, приклеить к стеклу равномерно для избежания образования воздушных пузырей, мешающих микроскопии.

— Концы ленты, выходящие за края стекла, отрезать.

— Микроскопировать при увеличении: объектив ×8 или ×10, окуляр ×7 или ×10.

4.2.3.2. Метод перианального соскоба с применением стеклянных глазных палочек с клеевым слоем по Рабиновичу

— Клей, обтекая лопаточку, образует прозрачную клейкую пленку, сохраняющуюся после высыхания не менее недели (что позволяет готовить палочки заранее).

— Установить глазные палочки в специальный штатив, где каждая ячейка имеет свой номер, или использовать пронумерованные пенициллиновые флаконы, предварительно закрепив ручку глазной палочки в резиновой пробке от этого пузырька.

— Взять соскоб путем соприкосновения или «отпечатка» плоской частью лопаточки обеих сторон с кожей перианальных складок.

— Снова укрепить палочку в штативе или пенициллиновых пузырьках (промаркированных соответственно номеру, присвоенному обследуемому по списку, или регистрационному номеру в журнале) для доставки в лабораторию.

— Укрепить глазную палочку в специальном держателе для просмотра под микроскопом.

— Микроскопировать непосредственно плоскую поверхность лопаточки поочередно с обеих сторон при увеличении: окуляр ×7 или ×10, объектив ×8 или ×10.

— Использованные палочки дезинфицировать кипячением в мыльном растворе, тщательно промыть, прополоскать, обезжирить в смеси Никифорова, просушить в сухожаровом шкафу. Штатив и кассеты обработать 70 %-ным спиртом и промыть мыльно-содовым раствором. Пенициллиновые пузырьки и резиновые пробки дезинфицировать кипячением или автоклавированием.

4.2.3.3. Метод перианального соскоба по Торгушину

— Ватный тампон, накрученный на деревянном или стеклянном шпателе, смочить в растворе глицерина.

— Обтереть тампоном перианальные складки вокруг ануса.

— На предметное стекло поместить каплю глицерина.

— Слегка ударяя по предметному стеклу, обмыть тампон в капле глицерина.

— Полученный препарат микроскопировать без покровного стекла; увеличение: объектив ×8 или ×10, окуляр ×7 или ×10.

4.2.3.4. Метод перианального соскоба по Кеворковой

— Налить в центрифужную пробирку около 5 мл кипяченой или дистиллированной воды.

— Поместить в него шпатель (палочку) с ватным тампоном.

— Перед забором соскоба слегка отжать тампон о внутреннюю стенку пробирки.

— Обтереть тампоном перианальные складки.

— Вложить шпатель с тампоном в пробирку с водой.

— Тщательно прополоскать тампон в пробирке с водой и удалить шпатель с тампоном из пробирки.

— Полученный смыв центрифугировать в течение 3 мин при 1500 об/мин.

— Слить надосадочную жидкость.

— Осадок перенести на предметное стекло, покрыть покровным стеклом.

— Микроскопировать при увеличении: объектив ×8 или ×10, окуляр ×7 или ×10.

Эффективность методов соскоба

— Эффективны для выявления яиц гельминтов, находящихся на перианальных складках: яйца остриц и онкосферы тениид.

— Методы перианального соскоба применяются для диагностики энтеробиоза, тениаринхоза и тениоза при индивидуальной диагностике или массовом обследовании детского и взрослого населения.

4.2.4. Копропротозооскопия (исследование фекалий на кишечные простейшие)

4.2.4.1. Метод нативного мазка с физраствором и раствором Люголя

Необходимые реактивы и оборудование

1. Физиологический раствор

2. Раствор Люголя 1 %-ный

3. Буферный раствор метиленового синего

4. Уксусно-кислый спиртовой раствор йода

5. Предметные и покровные стекла

6. Деревянные палочки

7. Стеклянные пипетки

8. Стерильная стеклянная или пластиковая посуда (для забора фекалий)

Подготовка к работе

Для исследования выбирают в первую очередь неоформленные фекалии, участки слизи или прожилки крови в кале.

Приготовление маточного 5 %-ного раствора Люголя: 10 г иодида калия растворить в 30 мл дистиллированной воды + 5 г кристаллического йода, размешать до полного растворения и долить до 100 мл дистиллированной водой. Хранить после приготовления в склянке из темного стекла.

Приготовление рабочего 1 %-ного раствора Люголя: 5 мл маточного 5 %-ного раствора Люголя соединить с 20 мл физиологического раствора, хорошо перемешать. Хранить в склянке из темного стекла не более 14 дней.

Приготовление буферного метиленового синего: 50 мл дистиллированной воды + 46,3 мл раствора уксусной кислоты (1,2 мл ледяной уксусной кислоты + 98,8 мл дистиллированной воды) + 3,7 мл раствора уксуснокислого натрия (1,6 г уксуснокислого натрия + 100 мл дистиллированной воды) + 0,5 г метиленового синего. Приготовленный раствор хорошо перемешивается, настаивается 15 мин и фильтруется.

Приготовление уксусно-кислого спиртового раствора йода: 10 мл спиртового раствора Люголя (40 мл 70 %-ного этилового спирта + несколько кристаллов йода, хорошо перемешать, раствор должен иметь цвет «крепкого чая») + 10 мл 25 %-ного раствора уксусной кислоты.

— Выбрать из пробы фекалий деревянной палочкой патологические примеси или немного фекалий (с булавочную головку) и перенести в каплю физраствора и растереть до получения равномерной негустой эмульсии, а затем поместить в каплю с Люголем и также растереть.

— Накрыть капли покровным стеклом (через правильно приготовленный мазок можно видеть газетный шрифт).

2. Для выявления ооцист кокцидий: при выполнении вышеописанной методики приготовления нативного мазка с физраствором и 1 %-ным раствором Люголя, в одну из капель вместо 1 %-ного р-ра Люголя вносится капля уксусно-кислого спиртового раствора йода. Палочкой внести небольшое количество фекалий, растереть, накрыть покровным стеклом; микроскопировать при тех же увеличениях. Ооцисты изоспоры выявляются, благодаря хорошей окраске ядер.

— Позволяет выявлять вегетативные формы патогенных простейших и комменсалов, анализировать тип их движения (что имеет важное значение при видовой идентификации простейших, особенно жгутиковых).

— Позволяет определять видовые признаки цист амеб и жгутиковых, ооцист кокцидий, благодаря эффективной окраске йодом ядер, жгутикового аппарата, гликогена.

— Применяется для диагностики кишечных протозоозов: лямблиоза, балантидиаза, амебиаза, кокцидиоза (изоспороза).

— Для исследования на кишечные простейшие, в т.ч. на лямблии используются также методы: формалин-эфирного (уксусно-эфирного) осаждения и исследование дуоденального содержимого (см. описание методик в п. 4.2.1.2, 4.2.1.3, 5.1).

4.2.4.2. Комплексный метод исследования фекалий на кишечные простейшие и гельминты из консерванта

Универсальный метод диагностики кишечных паразитозов, вызываемых простейшими (амебы, жгутиковые, в т.ч. диентамеба, балантидии и кокцидий) и гельминтами (нематоды, трематоды и цестоды).

В основе метода лежит «диагностическая система» КТ-ФЭО-МЦН: консервант Турдыева, формалин-эфирное обогащение, модифицированный метод окраски Циля-Нильсена.

Принцип метода: отбор проб фекалий производят в консервант Турдыева (п. 2.1.1), где паразиты фиксируются, и морфологические признаки простейших, яиц и личинок гельминтов сохраняются неизменными длительное время, это обеспечивает дальнейшее исследование материала из единой пробы:

— методом влажного мазка из консерванта;

— методом мазка из осадка после эфир-формалинового обогащения консервированного материала;

— модифицированным методом окрашивания по Цилю-Нильсену мазка из осадка после обогащения материала из консерванта.

Эффективность комплексного метода

— Выявляет весь спектр кишечных паразитов, в т.ч. редко диагностируемых простейших (диэнтамеба, изоспора), яиц и личинок гельминтов, не требующих специальных методов исследования (например, культивирования и т.п.) включая возбудителей оппортунистических инвазий (кокцидий, стронгилоидес).

— Повышается выявляемость сочетанных инвазий.

Необходимое оборудование и реактивы

1. Консервант Турдыева

2. Раствор Люголя 1 %-ный

3. Предметные и покровные стекла

4. Деревянные палочки

— На предметном стекле готовятся два препарата: пипеткой из консерванта с фекалиями, очень осторожно, не взбалтывая содержимое флакона, нанести две капли придонного осадка (в правой и левой части стекла).

— Растереть деревянной палочкой.

— В одну из капель добавить каплю раствора Люголя 1 %-ного.

— Каждую каплю накрывают покровным стеклом (покровные стекла можно окантовать вазелином для предотвращения высыхания и смещения покровного стекла).

— Микроскопируют при увеличении: объектив ×8 или ×10, окуляр ×7 или ×10, затем объектив ×40 (в отдельных случаях, например для криптоспоридий, применяют увеличение объектива ×90 или ×100 и микроскопируют с масляной иммерсией).

— Эффективен для выявления цист и трофозоитов простейших, включая редко выявляемую диентамебу, а также яиц и личинок гельминтов.

— Для диагностики кишечных протозоозов.

Необходимое оборудование и реактивы

1. Физиологический раствор

2. Раствор Люголя 1 %-ный

5. Палочки деревянные

6. Центрифужные градуированные пробирки

7. Воронки стеклянные

9. Стекла предметные и покровные

10. Пипетки стеклянные

11. Пробки резиновые

— Закрыть пробирку резиновой пробкой и тщательно перемешать, энергично встряхивая пробирку в течение 5 с.

— Полученную взвесь перелить в другую центрифужную пробирку через стеклянную воронку с двухслойным бинтом (марлей).

— Закрыть пробирку пробкой и энергично встряхивать в течение 30 с.

— Убрать пробку и дать постоять пробирке в течение 2 мин в вытяжном шкафу.

— Отделить палочкой образовавшуюся «каловую пробку» от стенок пробирки.

— Перевернуть пробирку дном вверх и вылить содержимое (можно ватным тампоном обтереть стенки пробирки, чтобы жидкость не стекала на дно и не увеличивала объем осадка), пробирку поставить в штатив.

— На предметное стекло по обе стороны от центра нанести по капле физиологического раствора и раствора Люголя.

— Перенести в каждую каплю осадок из центрифужной пробирки, размешать деревянной палочкой и накрыть каждую каплю покровным стеклом.

— Микроскопировать при увеличении: объектив ×8 или ×10, окуляр ×7 или ×10, затем с объективом ×40 (при необходимости использовать окуляр ×90 или ×100 с масляной иммерсией).

— Для диагностики цист кишечных простейших и яиц гельминтов.

Необходимые реактивы и оборудование

1. Смесь Никифорова

2. Серная кислота 10 %-ная

5. Палочки деревянные

6. Предметные стекла

7. Химические стаканчики или «мостики» для окрашивания мазков

8. Стеклянные пипетки

9. Кюветы эмалированные

— На предметное стекло нанести пипеткой каплю осадка из центрифужной пробирки после обогащения (п. 4.2.4.2.2) и круговым движением палочки приготовить мазок (можно добавить каплю физиологического раствора, чтобы мазок не был густым).

— Высушить на воздухе (тщательно).

— После фиксации мазок высушить на воздухе.

— Окрашивать мазок в растворе карболового фуксина (приготовление в п. 4.2.4.4), поместив мазок в химический стаканчик с этой краской на 45 мин!

— Промыть мазок проточной водой.

— Обесцветить мазок в 10 %-ном растворе серной кислоты до прекращения отхождения розовых «облачков» красителя.

Промыть тщательно проточной водой.

— Промыть мазок в воде.

— Высушить мазок на воздухе.

— Микроскопировать при увеличении: окуляр ×10, объектив ×90 или ×100 с масляной иммерсией.

— Для выявления ооцист кокцидий, включая криптоспоридии и изоспоры.

— Предварительная фиксация в консерванте и обогащение осаждением повышает выявляемость ооцист по сравнению со стандартной методикой диагностики ооцист кокцидий, включая криптоспоридии и изоспоры.

Необходимые реактивы и оборудование

1. Дистиллированная вода

2. Химические стаканчики

3. Палочки деревянные

5. Пробирки центрифужные

— Залить теплой (45 °С) дистиллированной водой, чтобы фекалии были полностью покрыты.

— Центрифугировать 2 мин при 1500 об/мин.

— Надосадочную жидкость слить, осадок с помощью стелянной пипетки перенести на предметное стекло (по 2 капли на каждое стекло), накрыть покровными стеклами.

— Микроскопировать при увеличении: объектив ×10, окуляр ×10; для уточнения морфологических особенностей: объектив ×40; окуляр ×10.

— Позволяет выявлять трофозоиты балантидий при низкой интенсивности инвазии.

— Для диагностики балантидиаза.

Необходимые реактивы и оборудование

2. Предметные стекла

3. Стеклянные или деревянные палочки

4. Горелка (спиртовка)

5. Кюветы эмалированные

6. Мостики стеклянные или «контейнеры» для окраски мазков

7. Пипетки, стеклянные капилляры

9. Химические стаканчики

10. Центрифужные пробирки объемом 15 мл

11. Металлические петли

Подготовка к работе

Приготовление рабочего раствора краски по Цилю-Нильсену

— Фуксина основного 2 г растворить в 12 мл спирта 96°-ного.

— Фенола 5 г растворить в 50 мл дистиллированной воды.

— Слить вместе растворы фуксина и фенола, долить дистиллированной воды до 100 мл, перемешать.

Подготовка материала для исследования

Из фекалий приготовить мазок одним из следующих способов.

— Нанести на предметное стекло небольшое количество фекалий

— Тщательно высушить мазок на воздухе (не менее 30 мин)

Б) Обогащение флотационным методом

— Разбавить фекалии водой, размешать

— Процедить разбавленные фекалии через 2-слойный бинт в центрифужную пробирку

— Удалить супернатант (объем оставшегося осадка не должен превышать 1 мл)

— Добавить флотационную жидкость до половины объема пробирки

— Размешать содержимое пробирки стеклянной палочкой

— Добавить флотационную жидкость до верхнего края пробирки

Собрать поверхностную пленку металлической петлей или стеклянным капилляром и поместить на предметное стекло

В) Обогащение методом седиментации

— Перемешать содержимое пробирки до образования однородной суспензии

— Процедить суспензию через двойной слой марли в другую пробирку

— Слить надосадочную жидкость

— Повторно залить осадок изотоническим раствором хлорида натрия

— Слить надосадочную жидкость

— Перенести осадок пипеткой на предметное стекло

— Приготовить из осадка мазок

Высушить мазки на воздухе (мазки, приготовленные одним из способов, описанных в п.п. А, Б, В).

— Высушить на воздухе.

— Промыть мазок водопроводной водой.

— Подкрасить в течение 5 мин 5 %-ным раствором малахитовой зелени.

— Высушить на воздухе.

— Микроскопировать при увеличении: окуляр ×10, объектив ×90 или ×100 с масляной иммерсией.

— Метод окраски фиксированных мазков по Цилю-Нильсену считается одним из наиболее надежных для выявления ооцист криптоспоридий.

Результат: ооцисты криптоспоридий окрашиваются в разные оттенки ярко-красного цвета и имеют вид округлых образований диаметром около 5 мкм. Оболочка ооцист окрашивается фуксином неравномерно. Сопутствующая микрофлора окрашивается в зеленые цвета.

— Применяется для диагностики криптоспоридиоза.

Количественными методами определяют число яиц гельминтов в 1 г или 1 мл фекалий. Данные методы дают ориентировочное представление об интенсивности инвазии, позволяют судить об эффективности лечения гельминтозов при частичном паразитологическом излечении.

4.2.5.1. Метод толстого мазка под целлофаном по Като-Кац (количественная модификация метода Като и Миура)

Необходимые реактивы и оборудование

1. Раствор Като (см. п. 4.2.1.1)

2. Целлофан гидрофильный

3. Предметные стекла

4. Валик или резиновая пробка

6. Пластинка размером 40×30 мм (из пластмассы или металла) с отверстием в центре диаметром 6 мм

— На предметное стекло поместить пластинку с отверстием.

— Произвольную навеску фекалий поместить на отверстие пластинки.

— Прокатать резиновой пробкой или пластмассовой разовой палочкой материал так, чтобы через отверстие в пластинке на стекло выдавилась стандартная навеска.

— Препарат обработать по стандартной методике Като (см. п. 4.2.1.1).

— При микроскопии просматривается весь мазок и ведется подсчет обнаруженных яиц гельминтов.

— Чтобы определить количество яиц в 1 г фекалий: число яиц, обнаруженных в данном препарате, следует умножить на коэффициент, равный 24.

— Применяется для определения интенсивности инвазии при клинико-диагностических обследованиях и при массовых обследованиях для определения напряженности очага инвазии.

4.2.5.2. Методы формалин-эфирного и уксусно-эфирного осаждения

Методы основаны на исследовании 1 г фекалий (количество фекалий, внесенное в пробирку и вызвавшее подъем жидкости на 1 мл, равно 1 г). При просмотре всего осадка полностью методы дают возможность провести количественный учет обнаруженных яиц, т.к. количество яиц в осадке соответствует нахождению их в 1 г фекалий.

Описание методов см. п. 4.2.1.2 и 4.2.1.3.

5. Микроскопическое исследование дуоденального содержимого, мокроты и мочи

5.1. Исследования дуоденального содержимого

Необходимые реактивы и оборудование

3. Центрифужные пробирки

4. Предметные стекла

7. Палочки стеклянные или деревянные

Подготовка к работе

Желчь в лабораторию должна быть доставлена сразу после зондирования. При подозрении на лямблиоз, стронгилоидоз, анкилостомоз, трихостронгилез тщательно исследуют порцию «А», исследование порций «Б» и «С» более информативно на печеночные трематодозы.

В желчи, исследуемой сразу после зондирования, обычно обнаруживаются вегетативные подвижные формы лямблий и подвижные личинки стронгилоидеса. При исследовании желчи через несколько часов после зондирования (но в день забора материала) обычно подвижность личинок стронгилоидеса и вегетативных форм лямблий не наблюдается.

5.1.1. Исследования нативного мазка желчи

— Выбрать сгустки слизи, волокон, патологические примеси.

— Палочкой стеклянной или деревянной (можно пипеткой) нанести тонким слоем желчь на предметное стекло (мазок не должен стекать с предметного стекла).

— При исследовании в чашке Петри налить желчь тонким слоем на дно чашки.

5.1.2. Исследования желчи с центрифугированием

— При наличии в желчи большого количества слизи или гноя взболтать все порции с равным количеством эфира.

— Надосадочную часть желчи слить в отдельную емкость.

— Осадок перенести пипеткой или прямо из пробирки на предметное стекло.

— Наиболее эффективно сочетание исследования желчи нативно и с центрифугированием.

— Исследование желчи на яйца трематод эффективно только при центрифугировании.

5.2. Исследование мокроты, промывных вод бронхов, лаважной жидкости

5.2.1. Исследование мокроты

Необходимые реактивы и оборудование

1. Раствор NaOH или КОН 0,5 %-ный

2. Центрифужные пробирки

3. Предметные стекла, большие предметные стекла

Подготовка к работе

Мокроту, представляющую собой патологический секрет дыхательных путей вместе с отделяемым носоглотки и полости рта, собрать в стерильную (можно прокипяченную) стеклянную емкость с крышкой и исследовать сразу после доставки в лабораторию.

Исследуется мокрота, выделенная при откашливании (не слюна и не слизь с носоглотки).

При слизисто-гнойной мокроте для лучшего растворения слизи, гноя:

— мокроту смешать с равным объемом 0,5 %-ного раствора едкой щелочи;

— слегка подогреть пробирку на водяной бане;

— пробирку энергично встряхивать в течение 5 мин.

5.2.1.1. Исследование нативного мазка мокроты

— Мокроту из стеклянной емкости пипеткой переносят на предметное стекло (лучше большое).

— Приготовить мазок путем равномерного растирания между двумя предметными стеклами или нанесения и равномерного растирания палочкой на большом предметном стекле.

— Микроскопировать при увеличении: объектив ×8 или ×10, окуляр ×10, для уточнения морфологических особенностей окуляр ×40.

5.2.1.2. Исследование мокроты с центрифугированием

— Перелить мокроту в центрифужные пробирки.

— Слить надосадочную жидкость.

— Перенести осадок пипеткой или сразу из пробирки на предметное стекло.

— Эффективен для выявления яиц гельминтов, паразитирующих в легких, бронхах (яйца парагонимуса, томинкса), иногда яиц шистосом.

— Менее эффективен при диагностике личиночных стадий кишечных нематод в период миграции через легкие (личинки аскарид, анкилостомид, стронгилоидеса).

— Иногда можно обнаружить личиночные стадии эхинококков (сколексы эхинококка, альвеококка) при поражении легких и прорыве пузырей в бронх.

— Для диагностики легочных гельминтозов.

5.2.1.3. Исследование окрашенных мазков на пневмоцистоз

Необходимые реактивы и оборудование

1. Центрифужные пробирки

2. Стеклянные палочки

3. Предметные стекла

Подготовка к работе

— Мокроту или другой материал рекомендуется исследовать немедленно. В исключительных случаях возможно временное сохранение лаважной жидкости с помощью консервации:

Подготовка предметных стекол: желательно использовать альбуминизированные стекла.

Приготовление мазков мокроты

— Поместить мокроту в центрифужную пробирку.

— Добавить равное количество муколитика.

— Полученную смесь быстро перемешать.

— Развести смесью формалина и спирта (1:1).

— Центрифугировать 10 мин при 1500 об/мин.

— Слить надосадочную жидкость.

— Осадок нанести на стекло в виде тонкого мазка.

— Мазок высушить на воздухе.

Приготовление мазков лаважной жидкости

— Поместить лаважную жидкость в центрифужную пробирку.

— Добавить равное количество 50°-ного спирта и перемешать.

— Центрифугировать 20 мин при 2500 об/мин.

— Слить надосадочную жидкость.

— Осадок нанести на стекло в виде тонкого мазка.

— Мазок высушить на воздухе.

A) Скрининговая окраска по Романовскому-Гимзе

— Опустить мазок в сульфатно-уксусный реагент на 10 мин.

— Промывать проточной водой в течение 5 мин.

— Высушить мазок на воздухе.

— Окрашивать 10 %-ной краской Романовского-Гимзы в течение 30 мин.

Б) Окончательная или специфическая окраска толуидиновым синим

— Высушенный мазок фиксируют в 10 %-ном растворе формалина.

— Промыть дистиллированной водой.

— Опустить мазок в сульфатно-уксусный реагент на 5 мин.

— Реагент перемешать стеклянной палочкой.

— Оставить мазок в сульфатно-уксусном реагенте еще на 10 мин.

— Промыть проточной водой.

— Высушить мазок на воздухе.

— Окрашивать 0,15 %-ным толуидиновым синим в течение 3 мин.

— Промыть проточной водой.

— Высушить мазок на воздухе.

— Докрашивать в 0,25 %-ном растворе водного метанилового желтого в течение 2 мин.

B) Окончательная или специфическая окраска по Гомори-Грохоту

— Промыть дистиллированной водой.

— Быстро подогреть раствор хромовой кислоты в стакане до 65 °С.

— В нагретый раствор быстро погрузить мазки на 1 мин.

— Промыть дистиллированной водой.

— Опустить мазки в 1 %-ный раствор метабисульфита калия на 1 мин.

— Приготовить раствор: 25 мл рабочего раствора серебра + 25 мл дистиллированной воды + 2 мл 5 %-ного водного тетрабората натрия + 15 мл диметилсульфоксида.

— Опустить мазки в приготовленный раствор.

— Прополоскать мазки в трех сменах дистиллированной воды.

— Опустить мазки в 0,2 %-ный водный раствор тиосульфата соды на 1 мин.

— Промыть дистиллированной водой.

— Окрашивать лихтгрюном в течение 5 мин.

— Промыть дистиллированной водой.

Результат: цисты светло- или темно-коричневые (цвет зависит от толщины мазка), округлой или чашеобразной формы, окружающий фон и тканевые элементы зелено-желтые.

Г) Окраска акридином оранжевым.

— Высушенные мазки фиксируют в абсолютном метаноле в течение 2 мин.

— Окрасить рабочим раствором акридина оранжевого 10 мин.

— Промыть дистиллированной водой.

— Высушить окрашенные мазки на воздухе.

— Микроскопировать под масляной иммерсией при увеличении: объектив ×90 или ×100, окуляр ×7 или ×10.

— Метод эффективен при условии немедленного исследования материала и использования двух вариантов окрашивания параллельно.

— Метод применяют для диагностики пневмоцистоза.

— Другой материал на пневмоцистоз (слизь из горла и гортани, аспираты из бронхов, биоптаты и мазки-отпечатки легочной ткани) исследуется так же, как и мокрота.

5.3. Микроскопические исследования мочи

1. Центрифужные пробирки

2. Стеклянные палочки

4. Предметные стекла

5.3.1. Метод концентрации

— Слить надосадочную жидкость.

— Осадок перенести пипеткой на предметное стекло.

— Микроскопировать без покровного стекла: объектив ×8 или ×10, окуляр ×10.

— Эффективен при диагностике мочеполового шистосомоза и редко встречаемой инвазии почечных лоханок: диоктофимозе.

— Иногда у девочек и женщин в моче можно обнаружить яйца остриц (смываемые мочой с промежности).

— Чаще применяется как специальный метод диагностики мочеполового шистосомоза.

5.3.2. Метод фильтрации

— Фильтруют под вакуумом через фильтровальную бумагу (или фильтры № 1).

— На увлажненных фильтрах обнаруживают яйца и личинки гельминтов при микроскопии.

— Микроскопируют при увеличении: объектив ×8 или ×10, окуляр ×10.

— Эффективен при слабой шистосомозной инвазии.

— Для диагностики мочеполового шистосомоза.

6. Ларвоскопическое исследование эпидермиса кожи

Необходимые реактивы и оборудование

1. Физиологический раствор

3. Стерильное лезвие бритвы или глазной скальпель

4. Стерильные чашки Петри

5. Физиологический раствор

6. Предметные и покровные стекла

Подготовка к работе

— Делают одновременно несколько срезов, главным образом с тех участков, на которых заметны изменения кожи и отмечается зуд (чаще в области гребешков подвздошной кости, боковых поверхностей грудной клетки).

— Помещают в стерильную чашку Петри с физраствором.

6.1. Метод исследования нативного препарата

— Биоптат эпидермиса кожи помещают на предметное стекло в каплю изотонического раствора хлорида натрия.

— Микроскопируют сразу после приготовления препарата при увеличении: объектив ×8 или ×10, окуляр ×10.

6.2. Метод «обогащенного» препарата

— Надосадочную жидкость сливают.

— Осадок переносят на предметное стекло и микроскопируют при увеличении: объектив ×8 или ×10, окуляр ×10.

— Эффективен при диагностике онхоцеркоза, кожного дипеталонематоза (стрептоцеркоза).

— Менее эффективен при кожных поражениях типа линейного дерматита, вызываемых мигрирующими личинками нематод, шистосом и др.

— При диагностике онхоцеркоза, кожного дипеталонематоза (стрептоцеркоза).

7. Ларвоскопическое исследование мышечной ткани для обнаружения личинок трихинелл

7.1. Метод трихинеллоскопии

Материал на исследование: поперечно-полосатая мышечная ткань, кроме мышцы сердца.

1. Стеклянный компрессорий или предметные стекла (размером 12×6 или 15×8 см)

2. Стереоскопический микроскоп МБС

3. Препаравальные иглы

5. Ножницы, скальпель

6. Измельчитель ткани

7. Эмалированные кюветы

8. Химические стаканчики

7.1.1. Компрессорная трихинеллоскопия

— Каждую пробу мышц перед исследованием помещают в чашки Петри, расположенные на эмалированных кюветах, куда помещают и необходимый инструментарий (ножницы, пинцеты, препаровальные иглы), предметные стекла. Работа проводится в перчатках с соблюдением правил техники безопасности.

— Каждый срез помещают на отдельный квадрат нижнего стекла компрессория (всего в компрессории 24 квадрата) и сдавливают верхним стеклом, путем завинчивания закрепляющих винтов компрессория. При отсутствии компрессория срезы помещают на большое предметное стекло, причем на значительном расстоянии друг от друга, чтобы во время сдавливания они не сливались. Накрывают сверху покровным стеклом меньших размеров и сдавливают до толщины папиросной бумаги.

— Микроскопируют все срезы (каждый срез в отдельности) применяя стереоскопический микроскоп МБС с увеличением: объектив ×2 или ×4, окуляр ×12; ×14; ×14,5.

— При обнаружении в мышцах хотя бы одной личинки трихинелл все пробы мышц утилизируют, перед этим засыпаются или заливаются дезинфектантами: 10 %-ным раствором лизола А, сухой хлорной известью или белильной термостойкой известью, или применяют водяной насыщенный пар под давлением 1,5 кГс/см 2 (0,15 МПа) 126 +- 2 °С. Инструментарий и лабораторная посуда обезвреживается кипячением в течение 60 мин (с момента закипания), или автоклавируются (при вышеуказанном режиме).

Диагностика личинок трихинелл бывает затруднена, если срезы толстые или кусочки мышц подсохли, или в срезах обильные включения жира, или пробы мышц фиксированы формалином, или личинки находятся в обызвествленных капсулах.

— можно поместить срезы мышц в 5 %-ный раствор едкой щелочи и выдержать в течение 1 ч при комнатной температуре или 10 мин в термостате при температуре 45 °С;

7.1.2. Трихинеллоскопия методом переваривания в искусственном желудочном соке

— Соляная кислота концентрированная (или 1 %-ная для 2-го варианта прописи)

— Медицинский пепсин кристаллический (или 3 %-ный для 2-го варианта прописи)

Подготовка к работе

— Мышечную ткань измельчают до состояния фарша.

— Готовят раствор искусственного желудочного сока по одной из прописей:

1) 1 л дистиллированной воды + 7 мл 1 %-ного раствора соляной кислоты + 5 мл 3 %-ного раствора пепсина;

— В химический стакан с желудочным соком помещают мышечную массу и тщательно размешивают.

— После переваривания всю массу помещают в аппарат Бермана, на сито из мельничного газа (№ 26).

Осадок переносят в чашку Петри или предметные стекла и микроскопируют под стереоскопическим микроскопом МБС, увеличение: объектив ×2 или ×4, окуляр ×12 или ×14.

При использовании 2-го варианта прописи желудочного сока реакция ускоряется и ход проведения методики меняется.

— Надосадочную жидкость сливают.

— Осадок микроскопируют в чашке Петри с использованием стереоскопического микроскопа МБС, увеличение: окуляр ×12, ×14, ×14,5; объектив ×2, ×4.

— Непереваренные мышечные волокна можно окрасить 0,25 %-ным раствором бриллиантового зеленого, в результате хорошо видны недекапсулированные личинки трихинелл.

— Метод компрессионной трихинеллоскопии эффективен при высокой и средней интенсивности трихинеллезной инвазии.

— При низкой интенсивности инвазии более эффективен метод переваривания в искусственном желудочном соке.

Применяется как метод прямой диагностики для обнаружения личинок трихинелл в мышечной ткани.

8. Микроскопическое исследование костного мозга, содержимого кожных язв и бугорков на лейшмании

Материал на исследование: костный мозг, язвенный краевой инфильтрат, содержимое кожных бугорков.

8.1. Метод мазка из кожного инфильтрата

Отбор материала на исследование

— Бугорок или участок инфильтрата протирают ватным спиртовым тампоном.

— Стерильным скальпелем делают поверхностный надрез кожи (при этом сдавливают пальцами бугорок для обескровливания).

— Со дна и краев надреза этим же скальпелем берется соскоб пораженной ткани (в случае появления крови при разрезе, ее удаляют стерильным марлевым тампоном).

— Соскоб со скальпеля быстро перенести на предметное стекло и равномерно растереть (готовят несколько мазков).

— Приготовленный мазок высушить на воздухе.

— Фиксировать метанолом или в смеси Никифорова.

— Окрашивать по Романовскому (как мазки крови на малярию).

— Микроскопировать с масляной иммерсией: объектив ×90 или ×100; окуляр ×7 или ×10.

2) В правильно приготовленном препарате хорошо различимы клетки инфильтрата (макрофаги, эндотелиальные, плазматические, лимфоидные клетки, фибробласты и небольшая примесь клеток периферической крови).

— Наличие в препарате эпителиальных клеток, а также бесструктурных глыбок, окрашивающихся в равномерно сиреневый цвет, означает, что соскоб был взят слишком поверхностно и должен быть повторен.

— Лейшмании легко обнаруживаются в бугорках и в краевом инфильтрате язвы на начальных стадиях изъязвления; в гнойном отделяемом язвы могут быть обнаружены лишь деформированные и разрушающиеся лейшмании (по которым трудно поставить диагноз); на стадии заживления в пораженных тканях лейшмании обнаруживаются редко; при туберкулоидном лейшманиозе в бугорках обнаруживаются с трудом.

— Для диагностики кожного лейшманиоза.

8.2. Метод мазка костного мозга

— Материал, полученный при пункции костного мозга, немедленно после взятия переносят на предметное стекло.

— Очень осторожно, чтобы не деформировать клетки, распределить при помощи шлифовального стекла тонким слоем.

— Если пунктат плотный, то мазок можно сделать по принципу «отпечатков», держа комочек пунктата пинцетом или иглой, или прикасаясь к нему предметным стеклом.

— Мазок высушить на воздухе.

— Фиксировать: в абсолютном этиловом спирте или в смеси Никифорова 30 мин, или в метиловом спирте 5 мин.

— Высушить на воздухе.

— Промыть дистиллированной водой.

— Высушить на воздухе.

— Микроскопировать с масляной иммерсией: объектив ×90 или ×100, окуляр ×7 или ×10.

— Для диагностики висцерального (внутреннего) лейшманиоза.

Примечание. При висцеральном лейшманиозе есть вероятность обнаружения паразитов и в периферической крови; в отдельных случаях для диагностики висцерального лейшманиоза исследуют пунктаты селезенки, печени и лимфатических узлов.

9. Особенности техники микроскопирования при исследовании на яйца, личинки гельминтов и цисты простейших

1. Важным условием успешного микроскопирования является регулирование света с помощью конденсора и других приспособлений светорегуляции: например, полностью опущенный конденсор обеспечивает максимальную контрастность, полностью поднятый конденсор обеспечивает максимальную яркость изображения. При исследовании на яйца гельминтов желательна большая контрастность, при исследованиях на простейшие необходимо обеспечить достаточную яркость изображения.

2. Поле зрения микроскопа при малом увеличении не должно быть слишком ярким (конденсор опустить вниз или уменьшить освещение), т.к. яйца гельминтов с прозрачной оболочкой могут остаться незамеченными. Это касается и простейших.

3. Во время просмотра препаратов при малом увеличении конденсор микроскопа опускают вниз, что уменьшает освещенность поля зрения и повышает четкость исследуемого материала. Переводя объектив на большое увеличение (×40), конденсор поднимают, что усиливает освещенность поля зрения.

4. Яйца и личинки в препарате могут находиться внизу, на поверхности и в толще капли (мазка), поэтому препарат просматривают по вертикали на всех уровнях. При этом очень важно отработать определенный автоматизм: одной рукой фиксировать и передвигать предметное стекло, а другой постоянно, плавно вращать винт макро- и микронаводки то в одну, то в другую сторону, чтобы исследовать всю толщину препарата.

5. Начинают исследовать препарат с правого или левого края предметного стекла, зигзагообразно, как при исследовании мазка крови, при этом препарат перемещают на одно поле зрения. Микропрепарат просматривают полностью, даже если были находки уже в первых полях зрения, т.к. может быть смешанная инвазия.

6. При гельминтоовоскопии лучше использовать объектив ×8, ×10 и ×40, окуляр ×7 и ×10 (поиск яиц ведется при малом увеличении, морфологическое строение и идентификация проводятся при большом увеличении); при протозооскопии работают с объективом ×40 и окуляром ×10.

7. При работе с микроскопом «БИОЛАМ» лучше пользоваться дневным естественным освещением или светом от ламп дневного освещения (настенных, настольных). В микроскопах «БИМАМ» (или импортных марок типа «Leica», «Zeiss») используется свет от вмонтированного электрического осветителя, при этом матовое стекло должно быть вставлено перед конденсором микроскопа.

8. Лаборанту начинать микроскопировать необходимо на микроскопе одной и той же марки, где он изучает не только морфологическое строение яиц гельминтов, но и учится визуально без измерительных приборов соизмерять величину обнаруженных объектов (яиц гельминтов, цист простейших и т.д.). При использовании одних и тех же увеличений микроскопы разных марок (разных фирм-производителей) дают разные размеры объектов, что может привести к диагностическим ошибкам.

9. Для исследования на личинки гельминтов можно использовать микроскоп стереоскопический системы МБС (увеличения: объектив ×12, ×14, окуляр ×2).

10. При идентификации яиц и личинок гельминтов, а также протозойных объектов можно использовать микрометрический метод диагностики. Измерения яиц гельминтов под микроскопом можно проводить с помощью окуляр-микрометра, но предварительно для каждого микроскопа и для тех увеличений, с которыми работает исследователь, нужно определить значение одного деления окулярной линейки в микронах.

10. Микрометрический метод протозоо- и гельминтоскопии

1. Микроскоп с необходимым набором окуляров и объективов

3. Объект-микрометр (линейка на стекле длиной 1 мм, значение величины одного деления 0,01 мм или 10 мкм)

Подготовка к работе

Определить до начала наблюдения значение цены одного деления шкалы окуляр-микрометра для каждой применяемой комбинации объектив-окуляр*.

— Поместить объект-микрометр на предметный столик микроскопа и сфокусировать окуляр на линейке объект-микрометра так, чтобы шкала делений стала резкой.

— Заменить простой окуляр на окуляр-микрометр, с которым предстоит выполнять измерения объекта, и удостовериться, что деление линеек окуляра и объект-микрометра расположены в одной плоскости.

— При малом увеличении объектива совместить шкалы линеек окуляр-микрометра и объект-микрометра параллельно друг под другом.

— Выделить (найти) такое положение линеек, где определенное число делений окуляр-микрометра полностью совпадает с целым числом делений объект-микрометра.

— Определить цену одного деления окуляр-микрометра: число интервалов на линейке объект-микрометра (У), строго соответствующих целому числу делений окуляр-микрометра, умножить на 10 мкм и затем разделить на число совпадающих делений шкалы окуляр-микрометра (X), т.е. цена одного деления шкалы окуляр-микрометра в данной оптической системе определяется по формуле (10×У:X).

— Аналогичным образом определить цену деления шкалы окуляр-микрометра для всех объективов микроскопа, с которыми предполагается проводить микрометрические исследования.

— При особо ответственных исследованиях проверять цену деления окуляр-микрометра при смене объективов даже в пределах одного типа.

* Следует помнить, что величина деления окуляр-микрометра меняется в зависимости от длины тубуса и увеличения окуляра и объектива используемого микроскопа.

Ход измерения объекта

— Выбрать соответствующий окуляр и объектив для работы**.

— Заменить простой окуляр на окуляр-микрометр.

— Определить число делений (интервалов) шкалы окуляр-микрометра, покрывающих длину и (или) ширину измеряемого объекта.

Определить действительный размер объекта путем умножения полученного числа на значение цены деления шкалы окуляр-микрометра при данной системе объектива и окуляра.

Метод позволяет осуществлять проведение прямых измерений величины объекта, не требует сложных расчетов, дорогой аппаратуры, доступен для лабораторий разного уровня.

— Дифференциальная диагностика псевдопаразитарных образований.

Приложение 1

Материал для исследования

Применяется для диагностики заболеваний

толстый мазок по Като и Миура

описторхоз, клонорхоз, фасциолез, дикроцелиоз, метагонимоз, нанофиетоз, дифиллоботриоз, гименолепидоз, аскаридоз, трихоцефалез, анкилостомидозы, дипилидиоз

описторхоз, клонорхоз, фасциолез, дикроцелиоз, метагонимоз, нанофиетоз, дифиллоботриоз, гименолепидоз, аскаридоз, трихоцефалез, анкилостомидозы, стронгилоидоз, трихостронгилез, некатороз, шистосомоз, кишечные протозоозы (лямблиоз, криптоспоридиоз, изоспороз)

аскаридоз, трихоцефалез, анкилостомидозы, трихостронгилез, некатороз, гименолепидоз, дифиллоботриоз, тениидозы

Бермана и его модификации

стронгилоидоз, трихостронгилез, анкилостомидоз, некатороз, балантидиаз

нативный мазок с физраствором и раствором Люголя

лямблиоз, балантидиаз, амебиаз, инфекции вызванные диентамебой, бластоцистоз

окрашенный мазок по Романовскому и др.

Торгушина, Кеворковой, Грэхэм, Рабиновича

тениаринхоз, тениоз, энтеробиоз

описторхоз, клонорхоз, фасциолез, дикроцелиоз, стронгилоидоз, трихостронгилез, анкилостомидоз, некатороз, лямблиоз, изоспороз, криптоспоридиоз

микроскопия окрашенных мазков по Цилю-Нильсену и др.

микроскопия окрашенных «тонких» мазков

малярия, филяриитозы, трипаносомозы

микроскопия «толстой» капли

Послеоперационный материал, пунктаты, срезы кожи и патматериал

личиночные стадии: эхинококкозы, трихинеллез, цистицеркоз, филяриетозы, амебиаз, балантидиаз

Спинно-мозговая жидкость, костный мозг

Биопсированная поперечно-полосатая мускулатура

Информативность серологических методов* исследования на паразитарные заболевания

описторхоз, клонорхоз, фасциолез, эхинококкоз, альвеококкоз, цистицеркоз, трихинеллез, токсокароз, криптоспоридиоз, пневмоцистоз, лямблиоз, амебиаз

описторхоз, эхинококкоз, альвеококкоз, трихинеллез, амебиаз

малярия, амебиаз, лямблиоз

* Серологические методы относятся к косвенным методам исследования, которые направлены на определение антител или антигенов в сыворотке крови или фекалиях, поэтому в данные методические указания не вошли. Следует при использовании тест-систем и диагностикумов для определения паразитарных заболеваний руководствоваться инструкциями к их применению, утвержденными Минздравом России.

Приложение 2

Возбудители гельминтозов и протозоозов относятся к «патогенным биологическим агентам» (ПБА) III и IV групп патогенности, что определяет режим работы паразитологических лабораторий (подразделений), выполняющих диагностические, производственные или экспериментальные работы с патогенными биологическими агентами.

1.1. Паразитологические исследования биологического материала от людей на паразитарные заболевания, санитарно-паразитологические исследования объектов внешней среды и пищевых продуктов на цисты патогенных простейших, яйца и личиночные формы гельминтов проводятся в лабораториях (подразделениях), лицензированных или аккредитованных в установленном порядке на данный вид деятельности.

1.2. При отсутствии аккредитации и лицензии паразитологические исследования проводятся по договорам с лабораториями других организаций и учреждений, аккредитованными в установленном порядке.

1.3. Для проведения лабораторных паразитологических исследований допускаются метрологически аттестованные методики, соответствующие НТД, ГОСТам, а также методики, утвержденные или допущенные к применению Госстандартом России, Минздравом и госсанэпидслужбой России.

1.4. Отбор проб для паразитологических исследований проводится в соответствии с требованиями государственных стандартов; методических указаний, утвержденных Департаментом госсанэпиднадзора Минздрава России.

2. Основные требования к размещению, набору помещений, оборудованию паразитологических лабораторий

2.1. Паразитологическая лаборатория может быть расположена в отдельно стоящем здании или специально приспособленной части здания. Допускается размещение на первом этаже в изолированной части жилого здания с отдельным входом.

2.2. Должно быть два входа: для сотрудников и для доставки материала на исследование, но допускается и наличие одного входа при условии передачи материала через передаточное окно.

2.3. Лаборатории должны размещаться в хорошо освещенных комнатах. Не допускается размещение в цокольных и подвальных этажах. На первом этаже нельзя размещать, если имеется затемнение перед окнами деревьями или постройками. При ориентации окон рабочих комнат на юг необходимо обеспечить защиту рабочих столов и оптики от прямого попадания солнечного света путем использования жалюзи из материала, устойчивого к дезинфицирущим средствам.

2.4. Лаборатория должна иметь вентиляцию, канализацию, отопление, водопровод, искусственное и естественное освещение (в соответствии с действующими нормативными документами).

2.6. Лаборатория должна иметь набор рабочих комнат, в соответствии с производственной мощностью и номенклатурой исследований. Выделяются отдельные лабораторные комнаты для работы с биологическим материалом, для санитарно- паразитологических исследований и серологических исследований.

В отдельных случаях допускается совмещение в одной лабораторной комнате исследований биологического материала и санитарно-паразитологических исследований, но при условии организации рабочих мест на каждый вид исследований и соблюдения норм площади на каждое рабочее место. А также разделение движения инвазионного и чистого материала во времени.

2.7. В лаборатории должна обеспечиваться «поточность», т.е. деление на «чистую» (врачебная, гардероб, кладовая, комната приема пищи и другие подсобные помещения) и «заразную» (приема материала, подготовки проб, моечная, стерилизационная или автоклавная для обеззараживания, термостатная, комнаты для проведения исследований) половины.

2.8. Если паразитологическая лаборатория размещена отдельно, то моечная может быть совмещена со стерилизационной и комнатой пробоподготовки.

2.9. Комнаты пробоподготовки, приготовления химреактивов, варки солевых растворов должны быть оборудованы вытяжной вентиляцией (приточно-вытяжного, или вытяжного типа через общую вытяжную сеть или индивидуально через окно, с выводной трубой выше здания). Вследствие использования при выполнении методик летучих и легко воспламеняющихся веществ (эфир, кислоты и т.п.) не разрешается совмещение вентиляции паразитологических лабораторий с лабораториями, где используется обжиг или муфельные печи.

2.12. Стены облицовывают на 1,5 метра от пола кафельной плиткой или другими современными строительными материалами, которые поддаются мойке и дезинфекции, или окрашиваются масляной краской.

2.13. Полы покрываются линолеумом, релином или плиткой для пола (не должны быть скользкими).

2.14. Лабораторные столы используются с пластиковым покрытием или другим покрытием, легко поддающимся дезинфекционной обработке.

3. Режим и правила работы с инвазионным материалом

3.2. Персонал лаборатории допускается к работе после проведения инструктажа по соблюдению требований биологической безопасности.

3.4. Обеззараживание материала и дезинфекция помещений.

3.4.1. Банки с фекалиями, желчью, мокротой и т.п. помещают в эмалированные кюветы или на отдельные столы стационарные или передвижные (с пластиковым или другим легко поддающимся дезинфекции покрытием).

3.4.2. Пробирки с кровью устанавливают в штативы, помещенные в эмалированные, пластиковые кюветы.

3.4.3. При отсутствии пластикового покрытия на столах для микроскопии используют легко поддающиеся дезинфекции стеклянные, металлические, пластиковые пластины или эмалированные кюветы, где раскладывают мазки, препараты, материал для исследования.

3.4.4. Отработанные предметные стекла, пипетки, пробки, пробирки, стеклянные палочки, химические стаканчики и т.п. складывают в течение рабочего дня в емкости с дезинфицирующим раствором до полного вертикального погружения (отечественные: 10 %-ный хлорамин, «Велтолен», «Аламинаг», или импортные дезсредства типа «Септодор», «Дианокс», «Виркон» и т.д., допущенные к применению в установленном порядке) для предварительного обеззараживания.

3.4.5. Заключительное обеззараживание лабораторной посуды проводится путем кипячения в воде (с момента закипания не менее 30 мин) с добавлением хозяйственного мыла или жидкого моющего средства. При соответствующих условиях можно использовать автоклавирование. После дезинфекции посуда допускается для мытья и стерилизации.

3.4.6. Ватно-марлевый материал, бумажные фильтры и разовые деревянные палочки уничтожаются путем сжигания или выброса в контейнер для мусора после экспозиции в одном из дезинфицирующих растворов, или предварительно засыпаются сухим порошком хлорной извести или хлорамина.

3.4.7. Пробы фекалий, мокроты, желчи, мочи засыпаются сухой хлорной известью или белильной термостойкой известью, или хлорамином перед выбросом в контейнеры или сливом в общую канализационную систему (при соответствующих условиях для обезвреживания используют автоклавирование).

3.4.9. Сгустки крови и сыворотку крови перед утилизацией в общую канализационную сеть обезвреживают только с применением дезинфицирующих растворов (в соответствии с действующими инструкциями по обеззараживанию).

3.4.10. Рабочие поверхности лабораторных столов обеззараживают 70 %-ным спиртом, с последующим фламбированием.

3.4.11. Дезинфекционная обработка оборудования (центрифуги, микроскопы, холодильники и др.) проводится раствором 70 %-ного спирта или с применением соответствующих дезсредств.

3.4.12. Дезинфекция халатов и полотенец проводится методом кипячения.

3.4.14. Для мусора используются ведра с педальным приспособлением для поднятия крышек и разовые полиэтиленовые пакеты для мусора.

3.4.15. Для дезинфекции воздуха лабораторного помещения и поверхностей используются бактерицидные лампы или аэрозольные дезинфицирующие вещества.

Личная гигиена лаборанта:

— работа с фекалиями, желчью, мокротой, кровью и другим биологическим материалом от людей проводится обязательно в резиновых перчатках, особенно в период подготовки материала и проведения методик;

— обработка рук после работы с инвазионным материалом заключается в предварительном мытье рук с мылом под проточной водой, затем обработка ватным тампоном с 70 %-ным спиртом (можно использовать дезсредства для гигиенической и хирургической обработки рук, например: «Велтосепт», «Асептинол С» и т.п.);

— перед выходом из лабораторного помещения снимать лабораторные халаты; иметь шкафы для халатов, сменной обуви и хранить отдельно от личной одежды.

Соблюдение правил дезинфекции, техники безопасности при работе с инвазионным и подозрительным на содержание возбудителей паразитарных болезней материалом как части противоэпидемического режима лабораторий, обязательно для всех сотрудников лаборатории. Текущий контроль за выполнением требований техники безопасности осуществляет руководитель лаборатории.

Источник

Что может являться материалом для паразитологического исследования

Лабораторная диагностика паразитарных болезней у людей

Правила отбора проб биоматериалов человека для лабораторной диагностики кишечных гельминтозов и протозоозов.

Что может являться материалом для паразитологического исследования

1. Область применения и нормативные ссылки

2. Отбор проб и условия доставки материала в лабораториюдля паразитологического исследования

2.1. Отбор проб и доставка фекалий (кала)

2.2. Отбор дуоденального содержимого (желчь)

2.3. Отбор проб мокроты

2.4. Отбор проб мочи

2.5. Отбор проб эпидермиса кожи

2.6. Биопсия мышечной ткани (поперечно полосатой мускулатуры)

1. Область применения и нормативные ссылки

2. Отбор проб и условия доставки материала в лабораторию для паразитологического исследования

2.1. Отбор проб и доставка фекалий (кала)

2.2. Отбор дуоденального содержимого (желчь)

2.3. Отбор проб мокроты

2.4. Отбор проб мочи

2.5. Отбор проб эпидермиса кожи

2.6. Биопсия мышечной ткани (поперечно полосатой мускулатуры)

2.7. Отбор проб для контроля эффективности лечения кишечных, печеночных гельминтозов и протозоозов

3. Паразитологические методы лабораторной диагностики

4. Исследование фекалий

4.1. Макроскопические методы

4.2. Микроскопические методы

5. Микроскопическое исследование дуоденального содержимого, мокроты и мочи

5.1. Исследования дуоденального содержимого

5.2. Исследование мокроты, промывных вод бронхов, лаважной жидкости

5.3. Микроскопические исследования мочи

6. Ларвоскопическое исследование эпидермиса кожи

6.1. Метод исследования нативного препарата

6.2. Метод «обогащенного» препарата

7. Ларвоскопическое исследование мышечной ткани для обнаружения личинок трихинелл

7.1. Метод трихинеллоскопии

8. Микроскопическое исследование костного мозга, содержимого кожных язв и бугорков на лейшмании

8.1. Метод мазка из кожного инфильтрата

8.2. Метод мазка костного мозга

9. Особенности техники микроскопирования при исследовании на яйца, личинки гельминтов и цисты простейших

Приложение 1

Приложение 2

2. Отбор проб и условия доставки материала в лабораторию
для паразитологического исследования